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代表挨拶
はじめに
研究内容
メンバー
研究成果

町田 千代子

小林 猛
高橋 広夫
小島 晶子
坂野 弘美
榊原 均
根岸 晴夫
松本 省吾
山木 昭平
エンダン・セミアルティ
研究発表
お問い合せ
中部大学
応用生物学部
生物機能開発研究所
植物バイオ研究センター
ヘルスサイエンスヒルズ
研究成果
葉の形を司る遺伝子の遺伝学的生化学的機能解析
(小島、小林、高橋チームと連携)
町田千代子 中部大学・応用生物学部・応用生物化学科・教授

【研究目的】

 葉は茎頂メリステムから分化する側生器官であり、光合成、蒸散において重要な役割をもつ。葉は、主軸であるapical-basal軸に対して新たに形成される副軸にそってつくられる器官であり、基部先端部軸、向背軸、中央側方軸の3つの軸にそって成長する。葉はこのような3つの軸にそった細胞分裂の結果、扁平で、中肋を中心としたおおよそ左右相称な側生器官として形成される。これまでに、葉の向背軸形成に関与する複数の遺伝子が単離され、また、小さなRNAが向背軸形成に関与している。3つの軸にそった葉の形成と左右相称的で扁平な葉の形成は、お互いに密接な関連があると考えられる。しかしながら、その初期分化過程はいまだ不明な点が多い。本研究では、左右相称で扁平な葉の形造りに重要な役割をもち、初期分化過程で機能すると考えられるASYMMETRIC LEAVES1 (AS1)とASYMMETRIC LEAVES2AS2)遺伝子に焦点をあてて、その機能を明らかにし、AS1AS2がどのような分子機構に関わっているのか解明する。このことによって植物の葉に共通な基本的な形成機構を探る。

 このような機構の分子的基盤が明らかになることは、動物とは明らかに違う植物の特徴である可塑性の理解にもつながる。さらに、生物の多様性の分子機構解明が期待される。本研究では、植物の増殖と分化に関わる遺伝子機能解析を行い、さらに、マイクロアレイの新規解析システムを確立し、新規遺伝子の探索と機能の解明を行い、植物の成長と発生・分化の遺伝子ネットワークの全容の解明を目的とした。

【研究結果】

(1) シロイヌナズナの葉の形成に関わるAS1とAS2タンパク質の核内における局在の解析

 植物の形態形成に関与する遺伝子はこの10年余りの間に複数単離されたが、それらは、すべて転写因子様の構造をもつタンパク質をコードしている。これらの中にあって、町田らが同定したシロイヌナズナのAS2遺伝子は植物の微妙な形態変化をになうバランサーとして機能していると考えられる極めてユニークなタンパク質をコードする(シロイヌナズナの42のメンバーからなるAS2/LOBファミリーに属す)。一方、AS1は、AS2と複合体を形成して機能する転写因子である。

 シロイヌナズナの葉の形成に関わるAS1とAS2タンパク質は核小体の周縁部で特定の新奇な構造体(AS2 bodyと命名)を形成していることがわかった(図1)。AS1とAS2は、核小体の周縁部で共同して下流遺伝子の抑制制御に関わる可能性が考えられる(図1D)。二種の波長の蛍光を同時に検出するために、本プロジェクトで購入したMETAシステム(本学既存の共焦点レーザースキャン顕微鏡にMATAシステムを設置)を使用した。この研究は、主に、石川研究員が担当した。(論文2, Plant Cell, 2007)。このようなAS2 bodyの局在には、AS2タンパク質のシステインに富む領域(C-motif)が必要であることがわかった(岩川研究員他、未発表データ)。また、シロイヌナズナにはAS2/LOBファミリーに属す42のメンバーがあるが、AS2は、構造的、機能的に唯一の遺伝子であることがわかった(論文13 Plant J. 2009)。

図1:S1とAS2タンパク質の核内における局在の解析

(2)マイクロアレイ情報の新規処理システムの開発と候補遺伝子の迅速抽出
(小林、高橋、小島チームと連携)

 本プロジェクトで購入したDNAマイクロアレイ解析システムを用いて、AS1, AS2遺伝子により制御を受けている遺伝子の探索を行った。シロイヌナズナの(@)野生株、(A) as1変異株、(B) as2変異株、(C) AS2過剰発現株に関し、Affymetrix社GeneChip ATH1を用いてそれぞれ遺伝子発現情報は町田らによって取得された。この発現情報データを解析に使用した。このアレイには、シロイヌナズナの遺伝子の対応する22746プローブが含まれており、前処理を行った。このデータに、小林が開発したFuzzyART法を改良した、知識ベースシステムを用いた新FuzzyART法によるクラスタ解析手法を適用した。その結果、AS1, AS2遺伝子により制御を受けている候補遺伝子が得られた。発生・分化に関わる植物遺伝子発現データ解析では、遺伝子の発現変化が一般的に小さく、解析が困難である。本手法は、知識ベースシステムに基づいているため、このような変化の小さい遺伝子も正確にクラスタリングできる利点が有る。この方法は、今後、さまざまな生命現象の解明に応用できると期待される(論文7, 8, J. of Biosci. & Bioeng., 2008)。

(3)シロイヌナズナの葉の発生分化過程でAS1、AS2遺伝子により制御される下流遺伝子の探索 (小島、高橋チームと連携)

図2:葉の形成におけるAS1とAS2による遺伝子発現制御ネットワークモデル

 マイクロアレイ解析から抽出された遺伝子について、リアルタイムPCRシステム(2007年度購入)により解析、さらに、変異体を使った解析から、図2に示したように、AS1, AS2は、葉の裏側化に関連する因子のうち、ETT, KAN2, YAB5を負に制御していることがわかった(論文4, Plant J., 2007)。さらに、誘導系を用いた解析、ChIPアッセイとChIP on chip法により、class 1 KNOX遺伝子群とETT, ARF4, YAB5を独立の経路で発現抑制していること、ETT, BPを直接制御していることがわかった。さらに遺伝学的解析から、葉の裏側化に関わるETTとともにARF4を制御している可能性を示した(論文投稿準備中)。ChIP on chip法には、本プロジェクトで購入したDNAマイクロアレイ解析システムを用いた。また、データ解析は、高橋チームが行った。これらの経路は、シロイヌナズナの葉の表側細胞の分化において非常に重要であることが遺伝学的にも示唆された。

(4) シロイヌナズナのAS1, AS2遺伝子の変異を亢進するケミカルの探索
(小島チームと連携)

 AS1, AS2が関わる分子機構を解明するために、as2変異体の表現型を亢進、または、抑圧する遺伝的変異株のスクリーニングを行い、向軸側(表側)細胞分化の異常が亢進されたと考えられる棒状の葉を形成する変異体、切れ込みが激しくなる変異体等、多くの亢進変異体候補が確認された(小島ら、論文投稿準備中)。一方、抑圧変異体は得られなかった。さらに、天然物由来の低分子化合物をスクリーニングし、フシジン酸等の低分子を同定した。これらのケミカルのターゲットについても解析中である。AS1, AS2が関わる葉の分化制御系には、小さなRNA生成因子やクロマチン再構築因子、リボソーム関連因子等の多くの制御系が関わっていることが示唆された。これらの解析から、AS1, AS2は、葉の表側(向軸側)の時間的、空間的細胞分化の守護神とも言える分化初期制御因子である可能性が考えられた。

図3:葉の形成におけるAS1とAS2による遺伝子発現制御ネットワークモデル

【原著論文等】

  1. Terakura, S., Kitakura, S., Ishikawa, M., Ueno, Y., Fujita, T., Machida, C., Wabiko, H. and Machida, Y. : Oncogene 6b from Agrobacterium tumefaciens induces abaxial cell division at late stages of leaf development and modifies vascular development in petioles. Plant & Cell Physiol., 47, 664-672 (2006)
  2. Ueno, Y., Ishikawa, T., Watanabe, K., Terakura, S., Iwakawa, H., Okada, K., Machida, C. and Machida, Y. : Histone deacetylases and ASYMMETRIC LEAVES2 are involved in the establishment of polarity in leaves of Arabidopsis. Plant Cell, 19, 445-57 (2007)
  3. Tanaka, H., Watanabe, M., Sasabe, M., Hiroe, T., Tanaka, T., Tsukaya, H., Machida, C. and Machida, Y. : Novel receptor-like kinase ABNORMAL LEAF SHAPE2 controls embryonic patterning and post-embryonic development of shoot organs through epidermal differentiation in Arabidopsis. Development, 134, 1643-1652 (2007)
  4. Iwakawa, H., Iwasaki, M., Kojima, S., Ueno, Y., Soma, T., Tanaka, H., Semiarti, E., Machida, Y. and Machida, C. : Expression of the ASYMMETRIC LEAVES2 gene in the adaxial domain of Arabidopsis leaves represses cell proliferation in this domain and is critical for the development of properly expanded leaves. Plant J., 51, 173-184 (2007)
  5. Semiarti, E., Indrianto, A., Purwantoro, A., Isminingsih, S., Suseno, N., Ishikawa, T., Yoshioka, Y., Machida, Y. and Machida, C. : Agrobacterium-mediated transformation of the wild orchid species . Phalaenopsis amabilis. Plant Biotechnology, 24, 265-272 (2007)
  6. Terakura, S., Ueno, Y., Tagami, H., Kitakura, S., Machida, C., Wabiko, H., Aiba, H., Otten, L., Tsukagoshi, H., Nakamura, K. and Machida, Y. : An oncoprotein from the plant pathogen Agrobacterium has histone-chaperone-like activity. Plant Cell, 19, 2855-2865 (2007).
  7. 佐藤信雄、小塩高広、中尾幸子、高橋広夫、岩川秀和、小島晶子、町田千代子、小林 猛 : シロイヌナズナに対するDNAチップを用いた遺伝子発現データのクラスタリング手法の比較, 中部大学応用生物学部紀要, 6, 1-10 (2007)
  8. Kitakura, S., Terakura, S., Yoshioka, Y., Machida, C., Machida, Y. : Interaction between Agrobacterium tumefaciens oncoprotein 6b and a tobacco nucleolar protein that is homologous to TNP1 encoded by a transposableelement of Antirrhinum majus. J. Plant Res. 121, 425-433(2008)
  9. Ishikawa, T., Machida, C., Yoshioka, Y., Ueda, T., Nakano, A., Machida, Y. : EMBRYO YELLOW gene, encoding a subunit of the conserved oligomeric Golgicomplex, is required for appropriate cell expansion and meristem organization in Arabidopsis thaliana. Genes to Cells 13, 521-535 (2008)
  10. Yang, J-Y., Iwasaki, M., Machida, C., Machida, Y., Zhou, X., Chua, N-H., : betaC1, the pathogenicity factor of TYLCCNV, interacts with AS1 to alter leaf development and suppress selective jasmonic acid responses. Genes & Development 22, 2564-2577 (2008)
  11. Takahashi, H., Iwakawa, H., Nakao, S., Ojio, T., Morishita, R., Morikawa, S., Machida, Y., Machida, C., Kobayashi, T. : Knowledge-based Fuzzy Adaptive Resonance Theory and its Application to the Analysis of Gene Expression in Plants. Journal of Bioscience and Bioengneering 106, 587-593 (2008)
  12. Semiarti E, Indrianto A, Purwantoro A, Isminingsih S, Suseno N, Machida Y, Kojima S. and Machida C.: Development of methods for Agrobacterium-mediated transformation of the wild orchid species Phalaenopsis amabilis and its application. Proceedings of Nagoya International Orchid Congress 2009, 1-7 (2009)
  13. Matsumura, Y., Iwakawa, H., Machida, Y., Machida, C.: Characterization of genes in the ASYMMETRIC LEAVES2/LATERAL ORGAN BOUNDARIES (AS2/LOB) family in Arabidopsis thaliana and functional and molecular comparisons between AS2 and other family members. Plant J. 58(3):525-37(2009)
  14. Ikezaki, M., Kojima, M., Sakakibara, H., Kojima, S., Ueno, Y., Machida, C., Machida, Y. :Genetic networks regulated by ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) and AS2 in leaf development in Arabidopsis thaliana: KNOX genes control five morphological events. Plant J. 61, 70-82 (2010)
  15. Semiarti E., Indrianto A., Suyono E.A., Nurwulan R.L., Restiani R., Machida Y. and Machida C.: Genetic Transformation of The Indonesian Black Orchid (Coelogyne pandurata Lindley) through Agrobacterium tumefaciens for Micropropagation Proceedings of Nagoya International Orchid Congress 2010, 16-20 (2010)
  16. Semiarti E., Indrianto A., Purwantoro A., Martiwi I. N. A., Feroniasanti Y. M. L., Nadifah F., Mercuriana I. S., Dwiyani R., Iwakawa H., Yoshioka Y., Machida Y. and Machida C. High-frequency genetic transformation of Phalaenopsis amabilis orchidsusing tomato extract-enriched medium for preculture of protocorms. J. of Horticultural Science & Biotechnology 85 205-210 (2010)

【特許】

  1. 特願2007-095868 町田泰則、町田千代子、Endang Semiarti ラン科植物の形質転換方法 (2007年3月 31日)
  2. 国際出願: PCT/JP2008/056227 町田泰則・エンダン・セミアルティ・町田千代子 ラン科植物の形質転換方法 国際出願日2008年3月28日

【受賞】

  1. 日本遺伝学会BP賞 町田千代子・岩川秀和・高橋広夫・Mazet Remi・岩崎まゆみ・小島晶子・小林 猛・町田泰則 シロイヌナズナの葉の発生分化に関わるAS2、AS1 による新規遺伝的ネットワークの解明 2008年9月 日本遺伝子学会第80回大会(於名古屋)
  2. 名古屋国際蘭会議NIOC奨励賞 Semiarti, E., Indrianto, A., Purwantoro, A., Isminingsih, S., Suseno, N., Machida, Y., Kojima, S. and Machida, C.  Development of methods for Agrobacterium-mediated transformation of the wild orchid species Phalaenopsis amabilis and its application. Nagoya International Orchid Congress 2009 (Nagoya)
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